熒光探針優(yōu)點(diǎn)是：一方面可以被氬離子激光(argon-ion laser)的488nm激發(fā)光激發(fā)，便于檢測(cè)；另一方面，和鈣離子結(jié)合后熒光變化更強(qiáng)，即對(duì)鈣離子濃度變化的檢測(cè)更加靈敏；同時(shí)，和鈣離子的結(jié)合能力較弱，這樣可以比Fura-2檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)更高濃度的鈣離子水平；此外，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的鈣離子的即時(shí)變化反應(yīng)得更加準(zhǔn)確，減小了因?yàn)楹外}離子解離速度慢而導(dǎo)致的熒光變化滯后。
熒光探針使用方法(僅作參考)
以下步驟是來(lái)源于大量文獻(xiàn)總結(jié)的簡(jiǎn)易操作流程，僅作參考。用戶需根據(jù)特定的應(yīng)用和敏感性來(lái)做調(diào)整。
1)將低溫保存的凍干粉取出回至室溫，低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無(wú)水DMSO或其他有機(jī)溶劑配制成1-10mM儲(chǔ)存液。未用完的DMSO儲(chǔ)存液需分裝并避光凍存在-20℃，避免反復(fù)凍融。
2)于正式實(shí)驗(yàn)前，用生理鹽緩沖液(比如：PBS，HBSS，HEPES)稀釋到工作濃度1-10μM。需根據(jù)具體應(yīng)用來(lái)調(diào)整合適的工作濃度。
3)吸走培養(yǎng)液，加入步驟2)配制的染色工作液到細(xì)胞內(nèi)，室溫或30℃孵育5~60min。
4)吸走染色工作液，用預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液清洗一遍。重新加入預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液，在適宜溫度內(nèi)孵育。對(duì)于二乙酸酯衍生物，需要短暫復(fù)原時(shí)間讓細(xì)胞內(nèi)酯酶將其水解，從而讓染料對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)。復(fù)原時(shí)間范圍很廣，由于某些細(xì)胞類型通常顯示極其低水平的酯酶活性。
5)將細(xì)胞暴露于實(shí)驗(yàn)刺激物之前，先測(cè)定加載細(xì)胞的背景熒光強(qiáng)度。
6)根據(jù)以下情況評(píng)估陰性對(duì)照(Negativecontrol)
6.1 綠色發(fā)射光譜內(nèi)檢查未染色細(xì)胞的自熒光情況。
6.2 對(duì)于流式分析，查明染料加載和處理后細(xì)胞的前向角散射和側(cè)向角散射是不變。細(xì)胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關(guān)，由于處理或有毒反應(yīng)引起的。
6.3 對(duì)包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無(wú)細(xì)胞混合物進(jìn)行熒光檢測(cè)。在不含細(xì)胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨著時(shí)間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。
6.4 檢查培養(yǎng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)液或簡(jiǎn)單緩沖液內(nèi)的未處理加載細(xì)胞(對(duì)照)的熒光。在健康細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)酶和/或天然抗氧化劑會(huì)清除這些氧自由基。經(jīng)過(guò)染料加載復(fù)原時(shí)間后，健康細(xì)胞應(yīng)該表現(xiàn)出低水平的熒光信號(hào)，且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間相對(duì)穩(wěn)定。然而，逐漸增加(由于自氧化)或降低(由于細(xì)胞內(nèi)染料喪失或光淬滅)也有可能觀察到。在不含任何刺激物或誘導(dǎo)劑的體系內(nèi)，健康和未處理細(xì)胞突然發(fā)現(xiàn)強(qiáng)熒光，表明細(xì)胞發(fā)生死亡或一些其他的氧化事件。
7)建立陽(yáng)性對(duì)照(Positivecontrol)，可能用以下方法刺激氧化活性：
7.1 腫瘤促進(jìn)劑(PMA，工作濃度100pM~10μM)
7.2 H2O2或TBHP(終濃度~100μM)(根據(jù)細(xì)胞本身對(duì)其的靈敏度和反應(yīng)性來(lái)提高或降低濃度)
8)確保刺激藥物或化合物不會(huì)引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會(huì)與氧化后染料的大激發(fā)或發(fā)射光譜發(fā)生重疊。
保存條件：
-20℃避光保存，6個(gè)月有效。
熒光探針使用注意事項(xiàng)：
本Fluo-3 AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
熒光染料均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
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